什么是熒光標(biāo)記
熒光標(biāo)記(Fluorescent labeling)是一種廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù),用于追蹤和定位目標(biāo)生物分子的代謝和運(yùn)動(dòng)軌跡。通過(guò)將熒光染料與目標(biāo)分子特異性地結(jié)合,熒光標(biāo)記使得目標(biāo)分子在顯微鏡下呈現(xiàn)出明亮的熒光信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物過(guò)程的實(shí)時(shí)觀察與定量分析。
熒光標(biāo)記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵體系化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物,受到紫外光或藍(lán)紫光照射時(shí),可激發(fā)成為激發(fā)態(tài),當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)基態(tài)時(shí),發(fā)出熒光。利用熒光標(biāo)記分子,將其共價(jià)結(jié)合在一些分子識(shí)別物質(zhì)(比如酶、抗原/抗體、DNA、適配體、多肽等)上作為探針,分子識(shí)別物質(zhì)與被檢測(cè)的對(duì)象(比如蛋白、多肽等)進(jìn)行反應(yīng)之后,根據(jù)熒光標(biāo)記分子在反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度變化,對(duì)被檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行各種定量的分析。
熒光標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)
1、熒光標(biāo)記的無(wú)放射物污染,操作簡(jiǎn)便
2、高靈敏度和空間分辨率
3、可視化等
這些優(yōu)點(diǎn),使得熒光標(biāo)記物在許多研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。
常見的熒光染料
1、香豆素系列:
香豆素和香豆素衍生物是紫外線可激發(fā)的藍(lán)色熒光染料,其發(fā)射波長(zhǎng)范圍約為390至480nm。用途最廣泛的香豆素包括AMCA,7-氨基香豆素(AFC和AMC),7-羥基香豆素和7-甲氧基香豆素的衍生物。
香豆素類熒光染料分子量很小,可紫外激發(fā),一般發(fā)藍(lán)色熒光(emission range ~410 to 470 nm),常常作為多色熒光靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)中藍(lán)光染料。由于價(jià)格便宜,個(gè)頭小,香豆素類染料常常用于標(biāo)記酶底物,從而可在細(xì)胞中,溶液中檢測(cè)酶活性



2、羅丹明系列:
羅丹明染料分子的激發(fā)波長(zhǎng)通常在500-600nm之間,而發(fā)射波長(zhǎng)在550-750nm之間。此外為了更適應(yīng)生物熒光成像,可以通過(guò)改變其結(jié)構(gòu)和偶聯(lián)元素使其吸收和發(fā)射紅移,進(jìn)而衍生了一系列近紅外羅丹明染料。羅丹明可以覆蓋從綠色到紅色廣泛的光譜,其中橙色熒光的四甲基羅丹明最常見,最常用。
羅丹明是3′,6’雙胺化的呫噸類(Xanthene)熒光染料。相對(duì)于熒光素染料(羥化呫噸),羅丹明(胺化呫噸)的熒光具有更好的pH穩(wěn)定性,并且胺化染料更容易結(jié)構(gòu)多樣化,不同結(jié)構(gòu)會(huì)得到不同波長(zhǎng)和顏色的熒光,因此羅丹明類染料可選用的熒光顏色更多,很多染料有比熒光素波長(zhǎng)更長(zhǎng)的熒光,是熒光素的有力補(bǔ)充。利用熒光素和各種羅丹明的組合,可以實(shí)現(xiàn)各種多色彩染色,標(biāo)記,追蹤,常常用于DNA測(cè)序,熒光免疫,微陣列的各種生物實(shí)驗(yàn)中。羅丹明特別適合核酸分子標(biāo)記,也可以用于dextran等高分子的標(biāo)記。由于大多數(shù)羅丹明水溶性差,標(biāo)記蛋白時(shí)容易產(chǎn)生蛋白聚集,熒光淬滅等問(wèn)題,需注意或者選擇其它熒光分子。

3、熒光素FITC系列:
FITC系列熒光染料的激發(fā)波長(zhǎng)為495nm左右,發(fā)射波長(zhǎng)為520nm左右,呈綠色熒光。常用的FITC系列有FITC,5-羧基熒光素,6-羧基熒光素,氨基熒光素等。熒光素(fluorescein)是最早使用,最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,也是使用最廣泛的熒光染料之一。它的兩種形式FAM (fluorescein amidite)和FITC (fluorescein isothiocyanate)常常見諸于文獻(xiàn)報(bào)道中。熒光素有很多優(yōu)點(diǎn):它量子產(chǎn)率很好,高達(dá)到0.94,因此初亮度非常明亮;它的水溶性很好,和蛋白偶聯(lián)不會(huì)產(chǎn)生沉淀問(wèn)題;它的激發(fā)峰是494nm,和常用的激光束488nm(argon-ion laser)很匹配。它的弱點(diǎn)是光穩(wěn)定性欠佳,長(zhǎng)時(shí)間照射熒光易淬滅,另外它的熒光對(duì)pH敏感,在偏酸性條件下熒光變?nèi)酢?/span>


4、CY系列:
Cy系列熒光染料包括Cy3、Cy5、Cy7等,它們的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)略有不同。Cy3的激發(fā)波長(zhǎng)為550nm左右,發(fā)射波長(zhǎng)為570nm左右;Cy5的激發(fā)波長(zhǎng)為650nm左右,發(fā)射波長(zhǎng)為670nm左右;Cy7的激發(fā)波長(zhǎng)為750nm左右,發(fā)射波長(zhǎng)為770nm左右。這些熒光染料常用于熒光免疫分析、熒光探針檢測(cè)、熒光染色以及生物熒光標(biāo)記等領(lǐng)域。Cy系列熒光染料具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性,能夠提供高靈敏度和高特異性的檢測(cè)結(jié)果,因此在生物醫(yī)學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。Cy(Cyanine)是一系列非常常用的熒光化合物。它們熒光比FITC,羅丹明等更亮更穩(wěn)定,在工業(yè)和生物技術(shù)中已有很多年的使用歷史。基于不同的化學(xué)結(jié)構(gòu),Cy染料的熒光可以覆蓋從紫外到近紅外幾乎所有光譜。
a、Cy2是一種發(fā)射綠色熒光的染料,光學(xué)性質(zhì)與羅丹明綠、FITC、AF488類似
b、Cy3 (Cyanine 3) 是一種發(fā)橘黃色熒光的花青素?zé)晒馊玖?/span>
c、Cy5是明亮的紅色熒光染料。由于它的激發(fā)和發(fā)射峰都在長(zhǎng)波長(zhǎng)紅光區(qū),而在這個(gè)區(qū)域生物樣品的自身熒光較弱,因此,相對(duì)于Cy3,Cy5具有明顯的靈敏度優(yōu)勢(shì)。
d、Cy7 屬近紅外熒光染料,它發(fā)射的熒光肉眼不可見但是可以被大多數(shù)熒光儀器識(shí)別


5、BODIPY系列
BODIPY染料可覆蓋所有的可見光光譜范圍,與各種儀器的參數(shù)都相匹配。 和AF系列,Cy系列染料一樣,硼二吡咯系列染料熒光明亮,消光系數(shù)高,光穩(wěn)定性好。確定是價(jià)格昂貴
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1、Visualizing Hydrogen Peroxide Diffusion in Soils with Precipitation-Based Fluorescent Probe
Wanchao Yu, Junye Ma, Mengxi Tan, Jingyi Wang, Xiaoshan Zheng, Binbin Wu, Baoliang Chen, and Chiheng Chu
Environmental Science & Technology 2025 59 (1), 545-552(硼酸酯熒光探針類)
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